實驗方案：微流控混合方式制備包裹mRNA的脂質納米顆粒

（mRNA-LNP的制備）

實驗目的

參照 Moderna、BioNtech 和 Alnylam 的新冠疫苗配方，以SM102、ALC-0315、MC3為主要陽離子脂質制備包載 mRNA 的脂質納米顆粒(lipid nanoparticles, LNPs)。

實驗原理

ALC-0315、 MC3、和 SM102 是三種可用于人體的脂質。在酸性條件下，質子化形成陽離子脂質，能夠通過靜電作用和帶負電的 mRNA 結合。脂質與溶有mRNA的水性溶液混合后析出，自組裝形成載有 mRNA 的脂質納米顆粒。本實驗中采用微流控混合法，讓脂質溶液與mRNA溶液在微混合器中充分、迅速、高度可重復地形成粒徑均一可控的LNP。在制備過程中，脂質溶解于乙醇，核酸溶解于酸性緩沖液中，故制備得到的LNP初產物含有高濃度乙醇。因此后續還需要透析或者超濾去除殘余的乙醇并將溶液體系置換至中性緩沖液中，以備后續生物學實驗及長期保存。
實驗材料：

[1]. 經測試，該三款注射器推桿較硬，推送液體較為準確

[2]. 此處不推薦NanoDrop檢測核酸濃度，其對降解核酸以及低濃度核酸檢測時會有較大波動

實驗步驟

1. 配制復方脂質-乙醇溶液：

LNP的成分與分子量見下表：

所有成分總濃度配制成 12 mM（約7.5 mg/mL）。如果需要摸索磷脂濃度對 LNP 最終粒徑的影響條件，可以配制以下濃度：8 mM（約5 mg/mL）、12 mM（約7.5 mg/mL）和16 mM（約10 mg/mL）等進行測試。需注意，低于4mM會難以形成均一的LNP，而過高濃度的磷脂反而會導致LNP粒徑的增大。不同磷脂濃度對LNP
粒徑的影響見 附錄-附件1。我們推薦使用12mM濃度的磷脂作為實驗的起始條件。

備注 ：配制好的磷脂溶液可于4℃密封保存半年。再次使用前請平衡至室溫，直至溶液澄清。陽離子磷脂保存條件比較苛刻 ，常溫下接觸空氣后會發生氧化變質，受潮則易析出。直接結果為合成 LNP時粒徑出現異常增大（如粒徑增大一倍以上），請確保妥善密封保存。

您也可以選擇購買FluidicLab的LNP（脂質納米顆粒）包封試劑盒。出廠前我們進行了嚴格的LNP合成檢測，以確保LNP合成的質量和穩定。

2. 配制檸檬酸緩沖液

使用超純水分別配制 100 mM 的一水合檸檬酸(分子量:210.14 ，稱取 1.05 g)和二水合檸檬酸鈉(分子量:294.10 ，稱取 1.47 g)溶液各 50 mL 。取 33.0 mL 檸檬酸溶液和 17.0 mL 檸檬酸鈉溶液混合，用NaOH調至pH =4 。隨后用超純水定容至 100 mL，加入終濃度0.1% 的DEPC靜置30分鐘。 高壓滅菌去除 DEPC，即得 50 mM檸檬酸緩沖液。檸檬酸緩沖液與乙醇配制的磷脂，需要分別用0.22 μm的MCE濾膜（檸檬酸緩沖液）與PTFE濾膜（乙醇配制的磷脂）分別過濾，確保其終產物不含微小的固態顆粒（包封試劑盒內含100mM檸檬酸緩沖液，稀釋后可直接使用）。

3. 計算RNA濃度，配制 mRNA-檸檬酸緩沖液：

氮磷比（N/P）是mRNA-LNP包封中常用的計算核苷酸用量與磷脂用量的參數。每個堿基含有一個磷酸根，1 mol的RNA或DNA即含有1mol的磷酸根（P）。磷脂中僅以可電離脂質比例計算氮原子數，每摩爾復方脂質中含有 0.5 mol氮原子（N）。

備注：雖然大多數的配方推薦的N/P比為6，但是實驗表明，在后續的混合和超濾過程中，會損失一定的磷脂。所以在實踐中，我們推薦您（可根據實驗需要）將N/P比提高為8。更高的N/P比可以降低超濾和透析引起
的粒徑變大，并提高 mRNA 的利用率。缺點是可能會增大對細胞的毒性 ，降低細胞的存活率。對于包封率，高N/P比也并無優勢。

常用復方磷脂濃度與緩沖液中核酸濃度對應表

4.微流控混合（智能LNP合成儀S1的操作說明）

4.1. 裝配芯片

將微流控芯片（B1-含魯爾口）的魯爾口朝上，裝入適配器中（圖1. A~C）。

圖1.  A.芯片適配器和微流控芯片；B. 微流控芯片魯爾口朝上裝入適配器中；C. 裝配完成；

4.2. 裝配反應倉

將B1芯片魯爾口朝內朝下，適配器把手朝外，裝入微流控反應倉（圖2. A~B）

4.3. 預沖洗芯片

實驗前的預沖洗步驟是十分關鍵且必要的，請務必將芯片中預先填充乙醇和緩沖液，以幫助LNP高質量地合成。

4.3.1. 注射器套筒的裝配（此處以5mL注射器套筒為例）

握住芯片適配器把手，向上轉動反應倉（圖3.A）； 轉動后可方便注射器適配器（套筒）的裝入（圖3. B）。隨后裝入符合需求的注射器套筒（使用20 mL注射器無需額外套筒）（圖3. C~D）。

圖3. C. 裝入符合需求的注射器套筒（使用20 mL注射器無需額外套筒）；D. 裝配完成示意圖。

4.3.2. 注射器及收集管的裝配（此處以5mL注射器為例）

用兩支注射器吸取乙醇與緩沖液，并排空氣泡（圖片未展示）。注意注射器吸取液體必需略大于實際實驗用量。以拇指與食指握住注射器，掛耳對準自己（圖4. A），向上插入反應倉套筒。向上插入稍稍遇到阻力后，在向上用力的同時旋轉注射器（圖4. B）。注意此處旋轉并非是為了螺紋旋緊，而是釋放對接中的應力，使得注射器與芯片連接更加牢固。裝配完注射器后，將反應倉向下轉動歸位（圖4. C），此時注射器與水平面垂直。最后安裝兩個15 mL離心管作為產物、廢液收集管（圖4. D）。安裝部分操作完畢。

4.3.3. 軟件的設置

首先連接設備電源。注意設備背后電源線處有一總開關。打開總電源開關后，打開前方控制面板電源。隨后進行注射器參數及運行程序的設置。點擊屏幕右上角注射器設置。依次選擇脂相和水相注射器參數（圖5.A）。正確的注射器參數才能保證準確的液體推送。請務必每一次實驗前檢查注射器參數是否與本次實驗所用注射器一致。隨后返回主頁面。

在主界面依次設置流速比，總流速，產物總體積，前后廢液等參數。預充洗推薦參數：流速比1：3；總流速12 mL/min；產物總體積3 mL。預充洗無需前后廢液，皆設為0 mL即可。設置完成點擊界面最下端“開始”圖標，即可開始預充洗。

4.3.4. 微流控混合制備LNP

1） 裝配或更換適合的注射器套筒；

2） 使用注射器吸取配制好的復方磷脂及mRNA-檸檬酸緩沖液，排空氣泡并與芯片連接。推薦最低吸取0.5mL；且吸取液體體積比實驗計算用量略大0.1~0.2mL。如以1：3的流速比計劃合成1mL終產物，0.2mL前廢液（ 即總產物1.2 mL ）。則至少吸取0.5 mL（ >0.3 mL，至少0.5mL ）的復方磷脂和1 mL（ > 0.9 mL ）的mRNA-檸檬酸緩沖液。

3） 裝配注射器，并于軟件中修改或確認注射器品牌及參數。

4） 設置合成參數。我們推薦初始合成參數為：流速比1：3； 總流速12 mL/min，前廢液0.2 mL，后廢液0 mL。對于B1芯片：一定區間內流速越大，粒徑越小，PDI也會越穩定。具體流速-粒徑/PDI對應關系，參數詳見附錄-附件2實驗數據。

5） 點擊“開始”圖標進行實驗，S1智能合成儀即可全自動切換前（后）廢液并收集產物。

5. 粒徑和PDI的檢測

mRNA-LNP產物可以使用動態光散射儀測定 LNP 粒徑和均一度。正常結果如下圖
mRNA-LNP產物可以使用動態光散射儀測定 LNP 粒徑和均一度。正常結果如下圖所示：

值得注意的是，由于LNP初產物中含25%乙醇，高濃度乙醇會導致直接檢測初產物粒徑有80%以上的偏差。因此需要及時地使用檸檬酸緩沖液將初產物稀釋5倍進行檢測。我們的實驗數據顯示，將乙醇的濃度稀釋至5%以下，所測量的粒徑才相對較為準確（誤差＜10%）。具體的稀釋數據參考 附錄-附件3 《乙醇濃度對LNP粒徑及PDI檢測的影響》。

數據參考 附錄-附件3 《乙醇濃度對LNP粒徑及PDI檢測的影響》。

備注：LNP初產物中高濃度乙醇會造成LNP融合，故推薦合成后立即用緩沖液稀釋。若進行透析則無需稀釋，盡快（10min內）將產物置于透析袋和透析液中進行透析。

6. 產物的處理和保存

可以根據實際情況選擇超濾或者透析來去除產物中的乙醇并置換緩沖液。如果希望獲得LNP粒徑更小的終產物，則推薦進行透析。具體對比見 附錄-附件4。

6.1．透析

1. 產物在制備后用注射器直接將產物移入透析卡（推薦使用Thermo的Slide-A-Lyzer? 透析盒，20 K MWCO）或20 KD預處理過的透析袋。

2. 將裝有LNP初產物的透析卡或透析袋置于至少50倍體積1 x PBS（pH=7.4），或50倍體積20 mM Tris-HCl
（pH=7.4）于4℃透析2h。

3. 將透析液更換為50倍體積，含有10% 蔗糖 的PBS（pH=7.4），或50倍體積，含有8% 蔗糖的20 mM Tris-HCl（pH=7.4）于4℃透析過夜。

4. 透析后LNP終產物可于4℃或-20℃進行保存。

6.2． 超濾

1. 樣品收集后 ，加入3倍體積的檸檬酸緩沖液稀釋。

備注 ：不建議直接使用 PBS 或者 Tris 緩沖液稀釋 ，過快改變 LNP 外環境 pH 會造成不可控的粒徑/PDI的增大。

2. 使用 Milipore 30 kD 超濾管，3000 g離心10 min，超濾至原體積的 1/4。（使用過小孔徑的超濾管會使得超濾困難，超濾時間延長。不建議使用10kD或更小的超濾管。）

3. 補加1 x PBS（或20 mM Tris-HCl）至原體積 ，再次超濾10 min，至原體積 1/4。

4. 重復步驟 3 兩次 ，將乙醇含量降低至 0.5%以下。

5. 最后一次使用含有蔗糖保護液的緩沖液超濾濃縮，使得PBS緩沖液的終產物中含有10%的蔗糖（Tris-HCl緩沖液終產物含有8%蔗糖）。

6. 將超濾后的液體收集，于4℃ 或 -20℃凍存。

Tips ：

LNP保存緩沖液與粒徑的關聯：

雖然根據 Moderna 公開數據顯示 ，SM-102 適合使用含有8%蔗糖 的 20 mM Tris buffer（pH=7.4） 進行保存，但是我們測試發現DLin-MC3-DMA，SM102兩種配方使用含有10% 蔗糖的PBS（pH=7.4）透析后粒徑更小，且差異顯著。ALC-0315配方生成的LNP保存于兩種緩沖液中，粒徑/PDI接近。故，對粒徑有要求的實
驗者建議使用含有蔗糖的PBS進行透析和保存。

LNP保存時效與保存環境的關聯：

LNP-RNA產物于含有10 % 蔗糖的PBS中，-20℃ 條件下保存一個月，與新制備LNP-RNA產物比較，穩定性和體內效力兩者接近[1]。我們的實驗結果則顯示，4℃保存一個月，LNP產物粒徑/PDI基本穩定，且仍具有轉染細胞的能力。故，請4℃或-20℃保存。切勿進行-80℃凍存^[1]。

LNP轉染效率與保存緩沖液的關聯：

有文獻報道顯示DLin-MC3-DMA于TBS（Tris-buffered saline）緩沖液條件下轉染效率會高于PBS緩沖液^[2]。所以若對后續轉染細胞或小鼠有需求的實驗者，可以參考該文獻對緩沖液體系進行優化。

 [1]. Kim B, Hosn RR, Remba T, Yun D, Li N, Abraham W, Melo MB, Cortes M, Li B, Zhang Y, Dong Y, Irvine DJ. Optimization of storage conditions for lipid nanoparticle-formulated self-replicating RNA vaccines. J Control Release. 2023 Jan;353:241-253.

[2]. Henderson MI, Eygeris Y, Jozic A, Herrera M, Sahay G. Leveraging Biological Buffers for Efficient Messenger RNA Delivery via Lipid Nanoparticles. Mol Pharm. 2022 Nov 7;19(11):4275-4285.

實驗方案：使用Qubit測定LNP包封率及利用率
實驗目的

對制備的 LNP 包封 mRNA 的效果進行測定

實驗試劑

實驗耗材

實驗儀器

Qubit 4.0 Invitrogen

實驗步驟

檢測步驟可參考Qubit? RNA HS Assay Kit 說明書：Document Connect (thermofisher.cn)

操作步驟簡述如下：

1） 配制RNA檢測工作液：吸取 [(樣品數)+( 2 標曲)+( 1 )] μL的Qubit? RNA HS reagent，加入200 ×（[(樣品數)+( 2標曲)+( 1 )] μL的Qubit? RNA HS buffer，配成1:200比例配制工作液。

【如6個待測樣本，吸取（6+2+1）=9 μL的Qubit? RNA HS reagent，加入200 × (6+2+1) μL = 1800μL的Qubit? RNA HS buffer中配成工作液。】

2） 制作常規標曲，并于Qubit 4.0上進行標曲的校準

3） 檢測LNP合成終產物中，游離RNA含量。

【若濃度過低無法檢測，則吸取190μL工作液，加入10μL待測樣本，充分混勻后檢測。在Qubit 4.0中選擇1μL選項,并隨后將數值 ×10，進行10倍換算。】

4） 使用TE buffer或DEPC水配制 4 % Triton X-100，與LNP終產物1:1混合（5μL+5μL即可）。使用該終濃度為 2 %的Triton X-100破乳5分鐘。

5） 在常規標曲中添加 1 μL的 2 % Triton X-100，并于Qubit 4.0上進行含有Triton X-100新標曲的校準^[1]。

6） 測量LNP破乳后的RNA濃度。

【注意該RNA溶液在破乳時稀釋了1倍。真實濃度需要 × 2。】

7） 進行包封率的計算，公式為：

載藥量 = 破乳后讀值 - 破乳前讀值

包封率(%) = [載藥量/破乳后讀值] × 100%

8） 同時可進行RNA利用率的計算，公式為：

RNA利用率 (%) = [載藥量/RNA投入量] × 100 %

[1]. 經檢測，Triton X-100的存在會影響RNA檢測的準確度, 故推薦制作新標曲。

實驗方案：使用酶標儀測定LNP包封率

實驗目的

對制備的 LNP 包封 mRNA 的效果進行測定

實驗原理

Quant-iT? RiboGreen? RNA 試劑是一種超靈敏的熒光核酸染色劑 ，可檢測溶液中 1-200 ng 的核酸 ，這種核酸染料無法透過 LNP ，因此只有游離的未被 LNP 包載的核酸可 以被結合。Triton X-100 作為一種表面活性劑常被用做破乳劑，使用 1%的 Triton X-100 處理 獲得的 LNP-mRNA 可以使包載的核酸釋放 ，得到總核酸量。通過計算破乳前后核酸量的

差異得到載藥量 ，再除以總核酸量即可得到包封率 ，即：

包封率（%） =（破乳后定量-破乳前定量）/破乳后定量

實驗材料

實驗步驟

試劑準備等檢測步驟細節可參考Quant-iT? RiboGreen? RNA 試劑盒說明書。

1）將 20 × TE 用 DEPC 水稀釋至 1X；用稀釋好的 1 × TE 稀釋試劑盒中的標準品，稀釋成 2 μg/mL 及 100 ng/mL 兩種終濃度；

2）用 1 × TE 稀釋試劑盒中的 QuantiT?  RiboGreen? Reagen，稀釋成 200 倍及 2000倍兩種終濃度；注意要同時制作含有/不含有Triton X-100的兩套標曲；

按照下表在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入以下試劑 ，做復孔：

High range

Low range

3）LNP破乳。將Triton X-100用1 × TE稀釋到2%，取100μL加入CellCarrier-96 Ultra Microplates，加入1μL制備好的LNP，處理5分鐘，加入100μL 200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

4）LNP游離核酸測定。在CellCarrier-96 Ultra Microplates中加入100ul 1 × TE，取1μL制備好的LNP加進去，混勻，加入100μL 2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

5）讀板使用 SPARK 讀取熒光強度 ，激發光設置為480 nm，發射光為520 nm。

6）標曲制備

7） 樣品定量

載藥量 = 破乳后讀值-破乳前讀值

包封率（%） = 載藥量/破乳后讀值

8） 同時可進行RNA利用率的計算，公式為：

RNA利用率 (%) = [載藥量/RNA投入量] × 100%

實驗方案：mRNA-LNP轉染293T細胞

實驗目的

以 293T 細胞為例 ，使用包封了 EGFP-mRNA 的 LNP 對細胞進行轉染。

實驗步驟

1． HEK-293T 細胞消化。 

選取 P3 – P15之間的HEK-293T細胞^[1]。棄上清后PBS清洗。1 mL 胰酶37℃消化1min。使用1 mL 含10 % FBS的DMEM終止消化。輕柔吹打細胞，收集細胞懸液。

2． 細胞鋪板

室溫125 × g，離心5~10 min。棄上清，并以3mL，noPS，10 % FBS的DMEM重懸細胞。對細胞進行計數。取5 × 10⁴ 個細胞/24孔板單孔鋪板。每個孔中添加 1 mL noPS , 含10 % FBS的DMEM培養基。

3． 細胞轉染

可用lipo作為陽性對照進行轉染實驗。對于LNP轉染，直接加入包封完成的EGFP-mRNA-LNP即可。每孔添加500ng。若使用其他規格培養皿或培養板，保證包封在LNP內的EGFP-mRNA-轉染量達到終濃度500ng/mL即可。培養24h后即可觀察到熒光。

若mRNA-LNP濃度較高，可在轉染前使用opti-MEM對LNP進行稀釋或定容。

4． 檢測

在轉染48小時后，收集細胞，流式檢測 GFP信號陽性率。

細胞轉染結果見附錄-附件5

[1]. 大量的實踐結果表明，293T細胞被支原體感染后，雖不影響Lipo-mRNA的轉染，卻會極大降低mRNA-LNP的轉染效率。這會導致陽性對照正常，轉染實驗組無表達。請在轉染前，務必進行細胞支原體檢測，確保細胞的狀態。

附錄

附件清單：

附件1：復方磷脂濃度與粒徑/PDI的關系圖；

附件2：LNP合成總流速與LNP粒徑/PDI的關系圖；

附件3：乙醇濃度對LNP粒徑及PDI檢測的影響；

附件4：LNP合成超濾與不同條件透析對比

附件5：mRNA-LNP轉染HEK-293T

附件1：復方磷脂濃度與粒徑/PDI的關系圖

實驗條件： 儀器：Fluidiclab-S1 ；芯片：Fluidiclab-B1

MC3復方脂質配方：總流速：12 mL/min；流速比（脂相：水相）= 1 : 3；前廢液0.2 mL；LNP空包無mRNA；初產物未經過檸檬酸緩沖液稀釋。可見12 mM合成粒徑最小。

附件2：LNP合成總流速與LNP粒徑/PDI的關系圖

實驗條件：儀器：Fluidiclab-S1 ；芯片：Fluidiclab-B1

MC3配方：12 mM濃度；流速比（脂相：水相）= 1 : 3；前廢液 0.2 mL；LNP空包無mRNA；

初產物經檸檬酸緩沖液稀釋5倍后檢測：可見速度越高合成LNP粒徑越小。

附件3：乙醇濃度對LNP粒徑及PDI檢測的影響

LNP越稀釋粒徑越小？

LNP全稱Lipid Nanopartical（納米脂質顆粒）。常用LNP合成儀，利用微流控的方式在微流控芯片中進行高度可控的合成。LNP合成后，有一些老師發現使用馬爾文粒度儀測量LNP粒徑時，對LNP產物做了稀釋的粒徑小于LNP產物直接進行檢測。這是怎么回事呢？

眾所周知，馬爾文粒度檢測儀對于粒子粒徑大小的檢測基于粒子的布朗運動速率。所以液體的折射率/粘度等參數都會對檢測結果有所影響。這也是在進行粒度檢測之時需要選擇粒子所在溶液及液相參數的原因。

那不禁想問，LNP合成后所殘存的乙醇是否對LNP粒徑和PDI有影響？產物直接做檢測是否得到的是真實的粒徑？為了回答這些問題，我們進行了一系列驗證實驗。

25%乙醇會顯著增加粒徑的檢測值

一般LNP合成時，有機相（溶解了脂質的乙醇）：水相（溶解了mRNA的檸檬酸鈉緩沖液）的流速比為1：3。這就使得產物會有25%的乙醇。為了模擬這個乙醇濃度，我們在標準品70nm的單分散交聯聚苯乙烯標準微球（即70nm PS微球）中加入了25%乙醇進行檢測。與原始溶液中的標準微球相比，添加終濃度25%乙醇后，檢測到的粒徑值接近130nm，幾乎是原始粒徑的一倍（圖1.A）；而相比之下，添加終濃度為25%的檸檬酸鈉緩沖液中微球粒徑和PDI與原始檢測結果并無差異（圖1.A）。

A：終濃度為25%的檸檬酸緩沖液和25%的乙醇對70nm標準微球的稀釋測量結果；

B：標準微球的二度稀釋實驗。Error bar為樣本標準差；

N.S：無顯著差異；檢驗方式：Student’s t-test。

乙醇改變粒徑檢測值而不改變其實際大小

熟悉材料學的朋友可能會提出異議，PS是會被乙醇降解的。這個結果是否是由于乙醇將PS微球溶解從而導致檢測粒徑增大呢？為了回答這個問題，我們將上一步實驗得到的包含PS微球的25%的乙醇溶液再次進行了稀釋，將乙醇濃度降低至5%。結果發現，檢測粒徑重新變小，，且與直接加入5%的乙醇相比，粒徑數值沒有顯著差異（圖1.B）。粒徑可能被溶解從而增大，但并不會自發縮小。該結果可以認為，粒徑數值上的改變完全是因為乙醇濃度造成的影響。

推薦LNP合成后進行5倍稀釋（檢測時，乙醇終濃度≤5%）

意識到乙醇的存在會對粒徑檢測產生劇烈影響，那究竟在LNP合成后，稀釋多少倍進行檢測比較合適呢？我們在標準微球中加入了1%~25%的乙醇進行了反復測試，觀察乙醇對粒徑測量的影響。結果發現，即使2%的乙醇即可使得粒徑測量值有著顯著的增加（圖2）。并且隨著乙醇濃度的逐漸增加，標準微球的測量數值逐漸增加。但是根據圖1.B的結果我們可以知道，這僅僅是檢測數值的變化，并非粒子真實的粒徑改變。大家可以根據實際需要，參考我們的結果，進行LNP合成溶液的稀釋和粒徑檢測。

圖2：70nm PS微球的梯度稀釋實驗。Error bar為樣本標準差；

 N.S：無顯著差異；檢驗方式：Student’s t-test。

 雖然乙醇濃度越低越接近真實的粒徑值，但是我們仍推薦將乙醇濃度降低至5%附近進行檢測。不做進一步稀釋的原因是，過高的稀釋倍數會導致溶液環境的劇烈變化。尤其是使用PBS稀釋，會劇烈改變溶液的pH值。這將直接導致粒子電位的劇烈變化，從而使得LNP變得不穩定，PDI異常增大。過大的稀釋倍數也會同時使得LNP粒子濃度的下降，這將會大大增加馬爾文粒度檢測儀的檢測時長，降低精準度。5倍左右的稀釋既可以保證與真實粒徑的差異在15%以內，且PDI不會有劇烈波動（圖3）。

圖3：LNP稀釋倍數與粒徑/PDI的關系。
LNP合成條件：

脂相：Alnylam配方（Dlin-MC3-DMA/DSPC/cholesterol/PEG-2000-DMG=50/10/38.5/1.5，mol/mol），12mM脂質總濃度；

水相：檸檬酸緩沖液（50mM檸檬酸+50mM檸檬酸鈉，pH=4.0）,無mRNA；脂:水FRR（流速比）=1:3；總流速=12mL/min。使用儀器：FluidicLab（上海澎贊生物）LNP智能合成儀-S1。芯片：FluidicLab（上海澎贊生物）B1（魚骨）芯片。

附件4：LNP合成超濾與不同條件透析對比

實驗條件：儀器：Fluidiclab-S1 ；芯片：Fluidiclab-B1

MC3配方：12 mM濃度；流速比（脂相：水相）= 1 : 3；前廢液 0.2 mL； LNP空包無mRNA；

合成初始——初產物經檸檬酸緩沖液稀釋5倍后檢測；

超濾使用Millipore 15mL/30 kd 超濾離心管(外徑50mL尺寸)[UFC903096]。

透析使用Thermo Scientific? Slide-A-Lyzer 透析盒 (20K MWCO)[66003]。

超濾后濃縮則使用[66003]透析盒后再使用[UFC903096]進行濃縮。

實驗步驟參照第一節：《實驗方案：微流控混合方式制備包裹mRNA的脂質納米顆粒（mRNA-LNP的制備）》。

附件5：mRNA-LNP轉染HEK-293T

實驗條件：見：第5節：《實驗方案：mRNA -LNP轉染293T細胞》。